مقالات

الایزا ریدر Elisa Reader

الایزا ریدر Elisa Reader – معرفی , انواع و کاربرد

 ELISAالایزا  یک واکنش آنتی بادی آنتی ژن است.

الایزا   در سال 1971 توسط پیتر پرلمن و اوا انگوال در دانشگاه استکهلم سوئد معرفی شد.

الایزا  یک روش رایج آزمایشگاهی برای اندازه گیری غلظت آنتی بادی یا آنتی ژن در خون می باشد.

ELISA یک روش سنجش مبتنی بر  Plate  است که برای شناسایی و تعیین کمی موادی مانند پپتیدها ، پروتئین ها ، آنتی بادی ها و هورمون ها استفاده می شود.

بستر کروموژنیک چیست ؟

یک آنزیم متصل به آنتی بادی با یک لایه بی رنگ واکنش داده و یک محصول رنگی تولید می کند. به چنین بستری بستر کروموژنیک گفته می شود.

تعدادی از آنزیم ها برای الایزا مانند آلکالین فسفاتاز ، horse radish peroxidase و بتا گالاکتوسیداز استفاده شده است.

از بستر خاصی مانند دی هیدروکلرید ارتو-فنیل دی آمین (برای پراکسیداز) ، پارانیتروفنیل فسفات (برای آلکالن فسفاتاز) استفاده می شود که توسط آنزیم های فوق هیدرولیز می شود و محصول نهایی رنگی می دهد.

اساس دستگاه الایزا ریدر

الایزا به طور معمول در صفحات پلی استایرن 96 چاهکی  انجام می شود.

سرم در یک چاهک  اصطلاحا incubated  می شود و هر چاهک حاوی سرم متفاوتی است.

یک سرم کنترل مثبت و یک سرم کنترل منفی در میان 96 نمونه مورد آزمایش قرار می گیرند.

 آنتی بادی ها یا آنتی ژن های موجود در سرم توسط آنتی ژن یا آنتی بادی متناظر با سطح جامد پوشانده می شوند.

 بعد از مدتی ، plate  بوسیله  wash buffer  شسته می شود تا سرم و آنتی بادی ها و آنتی ژن های unbound  از بین برود. برای شناسایی آنتی بادی ها  و یا آنتی ژن های متصل شده  ، یک آنتی بادی ثانویه که به آنزیمی مانند پراکسیداز یا آلکالن فسفاتاز متصل می شود ، به هر  well  اضافه می شود.

پس از یک دوره فرایند انکوباسیون ، آنتی بادی های ثانویه غیرقابل اتصال شسته می شوند.

هنگامی که یک بستر مناسب اضافه می شود ، آنزیم با آن واکنش داده و یک رنگ ایجاد می کند.

 این رنگ تولید شده به عنوان تابعی یا کمی از آنتی ژن ها یا آنتی بادی های موجود در نمونه داده شده قابل اندازه گیری است.

 شدت رنگ / چگالی نوری در 450nm اندازه گیری می شود. شدت رنگ نشانه ای از مقدار آنتی ژن یا آنتی بادی است.

انواع الایزا

غالباً 4  نوع ELISA بر اساس ساختار اتصال بین آنتی بادی و آنتی ژن وجود دارد.

1. الایزا مستقیم Direct ELISA

2- الایزا غیرمستقیم  Indirect ELISA

3- ساندویچ الایزا  Sandwich ELISA

4- رقابتی  Competitive

الایزا مستقیم  Direct ELISA

در یک الایزا مستقیم ، آنتی ژن به پایین میکروپلیت متصل می شود و سپس توسط آنتی بادی که مخصوص آنتی ژن است و همچنین با آنزیم یا مولکول دیگری که تشخیص را ممکن می کند ، متصل می شود.

الایزا غیرمستقیم

آنتی بادی را می توان با الایزا غیرمستقیم تشخیص داد و یا تعیین کمی کرد.

در این روش ، آنتی ژن به خوبی روی میکروتیتر پوشانده می شود. سرم یا برخی از نمونه های دیگر حاوی آنتی بادی اولیه به خوبی به میکروتیتر اضافه شده و اجازه داده می شود تا با آنتی ژن پوشش داده شده واکنش نشان دهد.

 هر آنتی بادی اولیه آزاد شسته شده و آنتی بادی متصل به آنتی ژن با افزودن آنتی بادی ثانویه آنزیمی متصل می شود كه به آنتی بادی اولیه متصل می شود. سپس آنتی بادی ثانویه غیرمستقیم شسته شده و یک لایه مخصوص آنزیم اضافه می شود. آنزیم سوبسترا را هیدرولیز کرده و محصولات رنگی ایجاد می کند.

مقدار محصول نهایی رنگی توسط اسپکتروفتومتری پلیت ریدر اندازه گیری می شود که می تواند میزان جذب همه  96  well plate را اندازه گیری کند.

روش الایزا غیرمستقیم

1. جایگاه های میکرو تیتر را با آنتی ژن آغشته کنید.
2. برای جلوگیری از نتایج مثبت کاذب ، همه unbound sites را مسدود کنید.
3. نمونه حاوی آنتی بادی (به عنوان مثال آنتی بادی مونوکلونال خرگوش) را به چاهک ها اضافه کرده و صفحه را در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوباته کنید.
4. plate را بشویید ، به طوری که آنتی بادی های unbound خارج شود.

5- آنتی بادی ثانویه متصل شده به آنزیمی (به عنوان مثال IgG anti- mouse ) اضافه کنید.

6. بشقاب را بشویید ، به طوری که آنتی بادی های پیوند نشده با آنزیم از بین بروند.

7-سوبسترا را اضافه کنید که توسط آنزیم تبدیل شده و یک محصول رنگی تولید می کند.

8. 8. واکنش یک بستر با آنزیم برای تولید یک محصول رنگی.

مزایای روش الایزا غیرمستقیم

• افزایش حساسیت ، زیرا بیش از یک آنتی بادی برچسب خورده به آنتی بادی اولیه متصل می شود.
• طیف گسترده ای از آنتی بادی های ثانویه دارای برچسب به صورت تجاری در دسترس هستند.
• حداکثر ایمنی بودن آنتی بادی اولیه حفظ می شود زیرا برچسب گذاری نشده است.
• تطبیق پذیر زیرا بسیاری از آنتی بادی های اولیه می توانند در یک گونه ساخته شوند و از همان آنتی بادی ثانویه دارای برچسب برای تشخیص استفاده شود.
• انعطاف پذیری ، از آنجا که می توان از آنتی بادی های مختلف تشخیص اولیه با یک آنتی بادی ثانویه labeled استفاده کرد.
• صرفه جویی در هزینه ، زیرا کمتر به آنتی بادی های labeled نیاز است.

معایب روش الایزا غیرمستقیم

• واکنش متقاطع ممکن است با آنتی بادی ثانویه رخ دهد و منجر به سیگنال غیر اختصاصی شود.
• یک مرحله incubation اضافی در این روش لازم است.

2. ساندویچ الایزا – Sandwich ELISA

آنتی ژن را می توان با ساندویچ ELISA تشخیص داد. در این روش ، آنتی بادی به خوبی روی میکروتیتر پوشانده می شود. یک نمونه حاوی آنتی ژن به چاه اضافه می شود و اجازه می دهد با آنتی بادی متصل به چاه واکنش نشان دهد و کمپلکس آنتی ژن – آنتی بادی ایجاد می کند.

پس از شستن چاه ، آنتی بادی دوم متصل به آنزیم مخصوص epitope متفاوت بر روی آنتی ژن اضافه شده و اجازه داده می شود تا با آنتی ژن متصل شده واکنش نشان دهد.

 سپس پس از شستن ، آنتی بادی ثانویه غیرمستقیم برداشته می شود.

سرانجام بستر به صفحه ای اضافه می شود که توسط آنزیم هیدرولیز می شود و محصولات رنگی را تشکیل می دهد.

روش ساندویچ الایزا

1. سطحی را آماده کنید که مقدار مشخصی از آنتی بادی به آن متصل شود.
2. نمونه حاوی آنتی ژن را به plate اضافه کرده و صفحه را در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوباته کنید.
3. plate را بشویید ، به طوری که آنتی ژن unbound خارج شود.

4- آنزیم پیوندی آنتی بادی ها را که مخصوص آنتی ژن هستند نیز اضافه کنید و سپس در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوباته کنید.

5- پلیت  را بشویید ، به طوری که آنتی بادی های پیوند نشده با آنزیم از بین بروند.

6. سوبسترا را اضافه کنید که توسط آنزیم تبدیل شده و یک محصول رنگی تولید می کند.
7. واکنش یک بستر با آنزیم برای تولید یک محصول رنگی.

مزایای ساندویچ الایزا –  Sandwich ELISA

• از آنجا که دو آنتی بادی استفاده می شود ، آنتی ژن به طور خاص ضبط و شناسایی می شود.
• برای نمونه های کمپلکس مناسب است ، زیرا آنتی ژن قبل از اندازه گیری به تخلیص نیاز ندارد.
• انعطاف پذیری و حساسیت ، زیرا می توان از هر دو روش تشخیص مستقیم و غیرمستقیم استفاده کرد.

الایزا رقابتی – Competitive ELISA

آزمایش الایزا رقابتی  برای اندازه گیری غلظت آنتی ژن در یک نمونه استفاده می شود.

در این آزمایش ، آنتی بادی ابتدا در محلول با یک نمونه حاوی آنتی ژن انکوباته می شود.

سپس مخلوط آنتی ژن و آنتی بادی به چاه میکروتیتر اضافه می شود که با آنتی ژن پوشانده شده است.

هرچه آنتی ژن موجود در نمونه بیشتر باشد ، آنتی بادی آزاد کمتری برای اتصال به چاه پوشش داده شده با آنتی ژن در دسترس خواهد بود.

پس از شستن  پلیت ، آنتی بادی ثانویه آنزیمی متصل به خاص برای ایزوتایپ آنتی بادی اولیه برای تعیین مقدار آنتی بادی اولیه متصل به پلیت اضافه می شود.

هرچه غلظت آنتی ژن در نمونه بیشتر باشد ، میزان جذب نیز کمتر می شود.

روش الایزا رقابتی – Competitive ELISA

1. آنتی بادی با نمونه حاوی آنتی ژن انکوباته می شود.
2. کمپلکس آنتی ژن – آنتی بادی به چاه میکروتیتر اضافه می شود که از قبل با آنتی ژن پوشانده شده است.
3. پلیت را بشویید تا آنتی بادی غیرقابل اتصال خارج شود.

4- آنتی بادی ثانویه متصل به آنزیم که مخصوص آنتی بادی اولیه است اضافه می شود.

5- پلیت  را بشویید ، به طوری که آنتی بادی های پیوند نشده با آنزیم از بین بروند.

6. سوبسترا را که توسط آنزیم به سیگنال فلورسنت تبدیل می شود اضافه کنید.

کاربرد الایزا  ELISA

1. وجود آنتی ژن یا وجود آنتی بادی در یک نمونه قابل ارزیابی است.
2. تعیین غلظت آنتی بادی سرم در آزمایش ویروس.
3. در صنایع غذایی هنگام شناسایی مواد حساسیت زا آلرژی احتمالی مورد استفاده قرار می گیرد.
4. در شیوع بیماری – پیگیری شیوع بیماری به عنوان مثال HIV ، آنفلوانزای مرغی ، سرماخوردگی ، وبا ، بیماری مقاربتی و غیره

الایزا ریدر  Elisa Reader  – معرفی  ، انواع و کاربردها

الایزا ریدر  Elisa Reader  – معرفی  ، انواع و کاربردها

برای خرید دستگاه الایزا ریدر یا میکروپلیت ریدر  لطفا  با شرکت رابین آزما تماس بگیرید