آنالیز ویتامین D در سرم با دستگاه LC/MS/MS

آنالیز ویتامین D ( 25-OH Vitamin D ) در سرم با دستگاه LC/MS/MS با Cleanup نمونه آنلاین خودکار

یک روش تحقیقاتی سریع و قابل اعتماد LC/MS برای تعیین کمیت دقیق، حساس و قابل تکرار 25-OH ویتامین D در سرم با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع HPLC مدل اینفینیتی Agilent 1260 Infinity LC همراه با طیف‌سنج جرمی تاندم مس Agilent 6460 با Agilent JetStream (AJS) ایجاد شد.

آماده سازی نمونه شامل یک استخراج ساده مایع-مایع simple liquid-liquid extraction است.

پاک‌سازی خودکار نمونه آنلاین Automated online sample cleanup، تداخل‌های ماتریس و سرکوب یون را به حداقل می‌رساند، که باعث بهبود کمیت بدون افزایش دست‌کاری نمونه می‌شود.

خطی عالی از 1 تا 250 نانوگرم در میلی لیتر با زمان اجرا تنها 5 دقیقه و دقت بین روز بسیار کمتر از 10٪ مشاهده شد.

مقدمه

انالیز متابولیت های ویتامین D همچنان به عنوان یک موضوع مورد توجه در انتشارات اخیر، عمدتاً به عنوان نشانگرهای زیستی برای وضعیت های احتمالی بیماری و کمبود ویتامین، بوده است.

در حالی که ویتامین D به دو شکل ویتامین D3 و ویتامین D2 وجود دارد، روش‌های الایزا فعلی واکنش‌های متقاطع متفاوتی را نشان می‌دهند و نمی‌توانند بین فرم‌های D2 و D3 متابولیت‌های ویتامین تمایز قائل شوند که منجر به گزارش اشتباه غلظت کل 25 هیدروکسی ویتامین D می‌شود.

علاوه بر این، به دلیل درجات مختلف زیستی، نیاز به یک دستگاه جامع مانند LCMSMS برای متمایز کردن اشکال D2 و D3 از اپیمرهای D2 و D3 وجود دارد.

چالش های تحلیلی با متابولیت های ویتامین D

مشکل خاص در تجزیه و تحلیل متابولیت ویتامین D، تمایز بین ایزوفرم اپیمر متابولیت های D2 و D3 است.

اپیمرها نسبت به متابولیت های D2 و D3 ایزوباریک isobaric هستند و آنها را در MS غیرقابل تشخیص می کند و بنابراین برای حل آنها به جداسازی کروماتوگرافی نیاز است.

ویتامین D به دو شکل (D2 و D3) وجود دارد که هر کدام متابولیسم مشابهی را برای تشکیل 25-هیدروکسی ویتامین D (25-OH D) انجام می دهند.

هر دو 25-OH D2 و D3 در خون اندازه گیری می شوند و اغلب در مجموع به عنوان ویتامین D یا25-OH D شناخته می شوند.

به منظور تعیین کمیت دقیق سطوح 25-OH D ، تمایز این متابولیت ها مهم است.

توانایی تشخیص دقیق این متابولیت ها به LC/MS کمک کرده است تا به عنوان روش تحقیق تحلیلی انتخابی مورد قبول واقع شود.

این مقاله کاربردی روشی را برای تعیین سریع، حساس و دقیق 25-OH D ویتامین D2 و D3 در سرم با استفاده از سیستم Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS مجهز به Agilent JetStream (AJS) توصیف می کند.

استفاده از آماده‌سازی نمونه استخراج مایع-مایع ساده و پاک‌سازی خودکار نمونه آنلاین، اثرات ماتریکس و سرکوب یون را کاهش می‌دهد، بدون اینکه تداخلی در تعداد زیادی از نمونه‌های سرم مشاهده شود.

تجربی

معرف ها و استانداردها

محلول‌های موجود 25-OH D2, 25-OH D3 و استانداردهای داخلی دوتره شده deuterated آن‌ها (IsoSciences) با غلظت 10 میکروگرم در میلی‌لیتر در متانول (Honeywell) تهیه و در دمای -20 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

محلول‌های استاندارد کالیبراسیون از این محلول‌های استوک با غلظت‌های 1، 25، 75، 125 و 250 نانوگرم در میلی‌لیتر در سرم تلفیقی تهیه شد (توجه: سرم تلفیقی حاوی سطوح درون‌زای متابولیت‌های ویتامین D است.

برای دستیابی به سطوح کالیبراسیون کمتر از سطح درون زا، سرم تلفیقی با آلبومین سرم گاوی 5 درصد رقیق شد. استانداردهای داخلی 25-OH D2 و D3 دوتره شده به 1000 نانوگرم در میلی لیتر با متانول رقیق شدند.

Automated Online Sample Cleanup

دستگاه HPLC مورد استفاده در این روش از نوع پمپ Binary می باشد

نمونه داخل ستون traping لود میشود

wash به Waste فرستاده می شود و مقدار ماتریس وارد شده به طیف سنج جرمی را کاهش می دهد.

کمی قبل از شستشوی آنالیت ها از ستون ترپ trapping column ، یک Valve سوییچ می شود و آنالیت ها بر روی یک ستون تحلیلی شسته می شوند، جایی که کروماتوگرافی بیشتر با استفاده از پمپ باینری binary دوم انجام می شود.

Sample Preparation

Serum samples were prepared with a simple liquid-liquid extraction:

Combine 15 μL of 1,000 ng/mL methanol:0.1% formic acid in water
Vortex for 30 seconds and let stand for 15 minutes at room temperature.
Add 750 μL of heptane and vortex for 30 seconds.
Centrifuge at 13,000 rpm for 5 minutes.
Transfer organic layer (top) to a clean tube.
Evaporate to dryness with nitrogen at room temperature.
Reconstitute in 200 μL of 75:25 methanol:0.1% formic acid in water

HPLC Configure

Agilent 1260 Infi nity Binary Pump (G1312B)

High Performance WP Sampler (G1367E)

Sampler Thermostat (G1330B)

Thermostated Column Compartment (G1316C with option #058)

Traping Column : Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 Guard column, 2.1 × 12.5 mm, 5 μm

Analytical Column : Agilent Poroshell 120 EC-C18, 2.1 × 50 mm, 2.7 μm

MS/MS Configure

Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS equipped with Agilent JetStream

Ion mode : Positive

آنالیز ویتامین D در سرم با دستگاه LCMSMS

آنالیز ویتامین D در سرم با دستگاه LCMSMS اجیلنت

نتیجه گیری

یک روش سریع و قابل اعتماد برای تشخیص دقیق، حساس و قابل تکرار 25-OH ویتامین D2 و D3 در سرم با استفاده از Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS ایجاد شده است.

خطی بودن عالی در محدوده 1 تا 250 نانوگرم در میلی لیتر نشان داده شده است.

یک استخراج ساده مایع-مایع به دنبال Clean up خودکار نمونه آنلاین، اثر ماتریکس و سرکوب یون را به دلیل لیپیدها و سایر ترکیبات بیولوژیکی موجود در سرم به حداقل می رساند.

آنالیز را می توان در کمتر از 5 دقیقه انجام داد.

سطح طبیعی ویتامین D سرم چقدر است؟

بین 20 تا 40 نانوگرم در میلی لیتر

نتایج عادی

محدوده طبیعی ویتامین D به صورت نانوگرم در میلی لیتر (ng/mL) اندازه گیری می شود.

بسیاری از کارشناسان سطح بین 20 تا 40 نانوگرم در میلی لیتر را توصیه می کنند. برخی دیگر سطح بین 30 تا 50 نانوگرم در میلی لیتر را توصیه می کنند.

مثال های بالا اندازه گیری های رایج برای نتایج این آزمایش ها هستند.

سرم ویتامین D برای صورت چه می کند؟

عنصر اصلی آن، ویتامین D، یک آنتی اکسیدان قوی است که خشکی پوست را تسکین می دهد و علائم پیری را کاهش می دهد.

از آنجایی که این سرم خاصیت ضد پیری دارد باعث افزایش لطافت و درخشندگی می شود.

سرم ضد پیری خاصیت ارتجاعی پوست را بهبود می بخشد، هیدراتاسیون پوست را افزایش می دهد و منافذ قابل مشاهده را به حداقل می رساند.

ویتامین D سرم چگونه اندازه گیری می شود؟

آزمایش ویتامین D یک آزمایش خون است. در طول آزمایش خون، یک متخصص مراقبت های بهداشتی با استفاده از یک سوزن کوچک از رگ بازوی شما نمونه خون می گیرد.

پس از وارد کردن سوزن، مقدار کمی خون در یک لوله آزمایش یا ویال جمع آوری می شود.

علائم کمبود ویتامین D چیست؟

ویتامین D به تقویت استخوان ها کمک می کند و ممکن است به پیشگیری از برخی سرطان ها کمک کند. علائم کمبود ویتامین D می تواند شامل ضعف عضلانی، درد، خستگی و افسردگی باشد.

…

علائم و نشانه ها ممکن است شامل موارد زیر باشد:

خستگی.

درد استخوان.

ضعف عضلانی، درد عضلانی، یا گرفتگی عضلات.

تغییرات خلقی، مانند افسردگی.

اگر ویتامین D کم باشد چه اتفاقی می افتد؟

کمبود ویتامین D می تواند منجر به از دست دادن تراکم استخوان شود که می تواند منجر به پوکی استخوان و شکستگی (شکستگی استخوان) شود.

کمبود شدید ویتامین D همچنین می تواند منجر به بیماری های دیگر شود. در کودکان می تواند باعث راشیتیسم شود.

راشیتیسم یک بیماری نادر است که باعث نرمی و خم شدن استخوان ها می شود

اگر ویتامین D 25-هیدروکسی کم باشد چه اتفاقی می افتد؟

سطوح پایین ویتامین D می تواند باعث مشکلات سلامتی مانند راشیتیسم و استئومالاسی شود.

آزمایش 25 هیدروکسی ویتامین D می تواند به فرد کمک کند تا تشخیص دهد آیا کمبود دارد یا در معرض خطر ابتلا به آن است.

دریافت ویتامین D کافی با بیرون رفتن روزانه زیر نور خورشید امکان پذیر است.

چگونه می توانم سطح ویتامین D خود را به سرعت بالا ببرم؟

زمانی را در نور خورشید بگذرانید. ویتامین D اغلب به عنوان “ویتامین آفتاب” شناخته می شود زیرا خورشید یکی از بهترین منابع این ماده مغذی است. .

ماهی های چرب و غذاهای دریایی مصرف کنید.

قارچ بیشتر بخورید .

زرده تخم مرغ را در برنامه غذایی خود بگنجانید.

غذاهای غنی شده بخورید.

مکمل مصرف کنید

یک لامپ UV را امتحان کنید.

ویتامین D در نتایج آزمایشگاهی چگونه است؟

دقیق ترین راه برای اندازه گیری میزان ویتامین D در بدن، آزمایش خون 25 هیدروکسی ویتامین D است.

سطح 20 نانوگرم در میلی لیتر تا 50 نانوگرم در میلی لیتر برای افراد سالم کافی در نظر گرفته می شود. سطح کمتر از 12 نانوگرم در میلی لیتر نشان دهنده کمبود ویتامین D است.

بررسی ارتباط بین کرونا و ویتامین D

در دهه گذشته، مطالعات نشان داده‌اند که مصرف ویتامین D می‌تواند احتمال ابتلا به عفونت‌های تنفسی مانند سرماخوردگی و آنفولانزا را کاهش دهد، به‌ویژه در میان افرادی که کمبودهای ثابتی دارند.

اکنون دانشمندان در تلاشند تا دریابند که آیا ویتامین D ممکن است به محافظت در برابر کووید-19 نیز کمک کند.

برخی از دانشمندان بر این باورند که افراد مبتلا به کمبود ویتامین D دارای پاسخ های ایمنی ضعیف یا غیرطبیعی هستند که آنها را مستعد ابتلا به کووید-19 و تجربه علائم شدید می کند.

این تصور که سطوح ویتامین D می‌تواند بر خطر ابتلا به کووید-19 تأثیر بگذارد، بحث‌هایی را در میان متخصصان برانگیخت و محققان در هاروارد و سایر دانشگاه‌ها را بر آن داشت تا کارآزمایی‌های تصادفی‌سازی را برای بررسی اینکه آیا ارتباطی وجود دارد آغاز کنند.

اما تاکنون، بیشتر شواهد این ادعا از مطالعات مشاهده‌ای ناشی می‌شود که علیت را اثبات نمی‌کنند.

و کارشناسان از مردم می‌خواهند در مورد مصرف دوزهای بالای مکمل‌ها احتیاط کنند، به این امید که مزایایی به دست آورند که ممکن است وجود نداشته باشد.

این گمانه زنی مبنی بر اینکه ویتامین D می تواند در برابر کووید-19 محافظت کند تا حدی به دلیل مشاهدات مبنی بر اینکه کمبودها به ویژه در میان گروه هایی که به طور نامتناسبی از ویروس کرونا آسیب دیده اند، مانند افراد مسن، ساکنان خانه سالمندان، و آفریقایی-آمریکایی ها، شایع است.

بدن ویتامین D را از طریق قرار گرفتن در معرض مستقیم نور خورشید سنتز می کند و افراد مسن، خانه دار یا پوست تیره تر تمایل به تولید سطوح پایین تری از آن دارند.

چاقی، یکی دیگر از عوامل خطر ابتلا به کووید-19 شدید، نیز با سطوح پایین ویتامین D مرتبط است.

عوامل اجتماعی-اقتصادی مانند کاهش دسترسی به مراقبت‌های بهداشتی و توانایی کمتر برای کار از خانه به نرخ‌های متفاوت بیماری و مرگ و میر ناشی از کرونا در میان اقلیت‌ها کمک می‌کند.

اما برخی از کارشناسان به شواهدی اشاره می کنند که سطوح پایین ویتامین D می تواند سیستم ایمنی را مختل کند.

ویتامین D به کاهش التهاب کمک می کند و می تواند ترشح پروتئین های ضد میکروبی را تحریک کند که ویروس ها و باکتری ها را از بین می برند.

یک تیم از محققان دانشگاه نورث وسترن مطالعه‌ای را منتشر کردند که هنوز مورد بررسی قرار نگرفته است و نشان می‌دهد که ویتامین D می‌تواند به فرونشاندن طوفان‌های سیتوکین، نوعی واکنش ایمنی که به نظر می‌رسد نتایج را برای بیماران کروناویروس بدتر می‌کند، کمک کند.

مطالعه دیگری که در سال 2017 در BMJ منتشر شد، داده‌های 25 کارآزمایی تصادفی‌سازی شده را بررسی کرد و به این نتیجه رسید که خطر ابتلا به عفونت‌های دستگاه تنفسی در افرادی که برای مصرف ویتامین D تعیین شده بودند در مقایسه با افرادی که دارونما دریافت کردند، 12 درصد کمتر بود.

اما این تأثیر در میان افرادی که به عنوان کمبود ویتامین D طبقه بندی می شدند، با سطوح خونی بسیار پایین، زیر 25 نانومول در لیتر (یا 10 نانوگرم در میلی لیتر) بیشتر بود: آنها با مصرف مکمل ویتامین، خطر ابتلا به عفونت های تنفسی را 70 درصد کاهش دادند. دی

سطح خون بین 20 تا 50 نانوگرم در میلی لیتر به طور کلی طبیعی در نظر گرفته می شود.

خلاصه

رزولوشن کروماتوگرافی هنوز نقش مهمی در کاربردهای LC-MS هنگام برخورد با ترکیبات ایزوباریک isobaric ایفا می کند.

انتخاب منحصر به فرد ستون Ascentis Express F5 یک روش تحلیلی سریع و کارآمد برای 25-هیدروکسی ویتامین D و اشکال مربوطه از نمونه های سرم ارائه می دهد.

علاوه بر این، کاهش فسفولیپیدها با استفاده از صفحه 96 چاهی HybridSPE-PLus، پاکسازی نمونه کارآمد را قادر به افزایش تکرارپذیری و دقت روش کرد.

همانطور که در این مطالعه نشان داده شد، این تکنیک آماده سازی نمونه جدید همراه با گزینش منحصر به فرد ستون Ascentis Express F5 یک روش تجزیه و تحلیل زیستی سریع و ساده برای متابولیت های ویتامین D مرتبط را امکان پذیر می کند.

به همین ترتیب، این رویکرد نشان می‌دهد که چگونه انتخاب‌پذیری، در مراحل کروماتوگرافی و آماده‌سازی نمونه، امکان تجزیه و تحلیل کارآمد را فراهم می‌کند که در غیر این صورت با رویکردهای فاز معکوس سنتی دست نیافتنی است.

آنالیز ویتامین D در سرم با دستگاه LC/MS/MS

کلیدواژه :سرم,ویتامین d , آنالیز ویتامین D در سرم با دستگاه LC/MS/MS,انالیز ویتامین d,ویتامین دی, آنالیز ویتامین D ( 25-OH Vitamin D ) در سرم با دستگاه LC/MS/MS,دستگاه تاندم مس انالیز ویتامین دی d,تست خون,سنجش سطح ویتامین D,دستگاه hplc برای انالیز ویتامین d,روشهای اندازه گیری ویتامین دی d,دستگاه تست ویتامین دی d,

لیست مقالات

مقالات