تفاوت HPLC با FPLC

FPLC Vs HPLC

Fast protein liquid chromatography ( FPLC ) Vs High performance liquid chromatography ( HPLC )

کروماتوگرافی مایع پروتئینی سریع Fast protein liquid chromatography (FPLC) و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا high performance liquid chromatography (HPLC) هر دو تکنیک های کروماتوگرافی مایع هستند که برای جداسازی مخلوط ها استفاده می شوند، اما چندین تفاوت کلیدی دارند.

هدف

FPLC برای خالص سازی بیومولکول های بزرگ مانند پروتئین ها، نوکلئوتیدها و پپتیدهای بزرگ استفاده می شود، در حالی که HPLC برای تجزیه و تحلیل ترکیبات شیمیایی کوچک استفاده می شود.

فشار- Pressure

FPLC از فشارهای کمتر، معمولاً در حدود 435 تا 580 psi استفاده می کند، در حالی که HPLC از فشارهای بالاتر، معمولاً حدود 3000 تا 15000 psi استفاده می کند.

مولکول های هدف – Target molecules

FPLC برای خالص سازی بیومولکول های بزرگ استفاده می شود، در حالی که HPLC برای جداسازی ترکیبات کوچک استفاده می شود.

تجهیزات دیگر

FPLC علاوه بر پمپ ها، آشکارسازها و شیرها از نمایشگرهای pH و رسانایی conductivity و همچنینfraction collectors استفاده می کند.

برنامه های کاربردی

FPLC را می توان برای آنالیز میلی گرم مخلوط یا برای تولید صنعتی کیلوگرم پروتئین خالص استفاده کرد.

سایر اصطلاحات

FPLC همچنین به عنوان بیوکروماتوگرافی biochromatography، جداسازی زیستی bioseparation یا زیست خالص سازی biopurification شناخته می شود

تفاوت FPLC و HPLC چیست؟

FPLC مخفف کروماتوگرافی مایع پروتئین سریع و HPLC مخفف کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا است.

در حالی که هر دو تکنیک مشابه هستند، تفاوت های قابل توجهی در روش های کروماتوگرافی آنها وجود دارد.

HPLC یک تکنیک تحلیلی است که عمدتاً برای تجزیه و تحلیل کمی و کیفی نمونه های مایع استفاده می شود.

از طرف دیگر، FPLC یک تکنیک خالص سازی است که برای جداسازی مخلوط های پروتئینی و جمع آوری اجزای جدا شده مورد علاقه استفاده می شود.

روش دیگر برای تمایز HPLC از FPLC این است که HPLC یک تکنیک تحلیلی در نظر گرفته می شود در حالی که FPLC یک تکنیک آماده سازی است.

در HPLC از روش های مختلفی برای جداسازی استفاده می شود که کروماتوگرافی فاز معکوس شایع ترین آنهاست.

HPLC از حلال برای فاز متحرک و FPLC از بافر نمک برای فاز متحرک استفاده می کند.

FPLC از چندین روش تخلیص از جمله تبادل یونی، فیلتراسیون ژل و میل ترکیبی و همچنین سایر روش‌های کمتر استفاده می‌کند.

تخلیص FPLC معمولاً یک فرآیند چند مرحله ای شامل ترکیبی از روش ها است.

سر پمپ های HPLC از فولاد ضد زنگ ساخته شده اند و قابلیت سرعت جریان معمولاً از 10 میلی لیتر در دقیقه تجاوز نمی کند، در حالی که قابلیت فشار برگشتی معمولاً 6000 psi و بالاتر است.

سر پمپ‌های FPLC از مواد تیتانیوم یا PEEK ساخته شده‌اند و پمپ‌های رومیزی می‌توانند جریانی تا 150 میلی‌لیتر بر دقیقه اما فشار برگشتی تقریباً 725 psi در این نرخ‌های جریان بالا ارائه دهند.

نرخ جریان در FPLC معمولاً بالاتر از HPLC است، جایی که فشارهای برگشتی معمولاً کمتر است.

همچنین ستون ها و همچنین مواد ستون و اندازه ذرات متفاوت هستند.

ستون های HPLC از فولاد ضد زنگ ساخته شده اند. ستون‌های FPLC از بدنه‌های شیشه‌ای با بالا و پایین رزین با کارایی بالا یا PEEK ساخته شده‌اند.

اکثر رزین‌های HPLC از دانه‌های سیلیکا با اندازه ذرات کوچک ساخته می‌شوند که می‌توانند فشارهای برگشتی بسیار بالایی را تحمل کنند.

FPLC از آگارز، مواد پلیمری یا مواد سیلیکا استفاده می کند. اندازه ذرات برای FPLC بزرگتر است و دارای منافذ بزرگ است.

رزین های FPLC به دلیل مواد و اندازه هایی که قبلا ذکر شد، قادر به تحمل فشارهای برگشتی بسیار بالا نیستند.

HPLC معمولاً از فولاد ضد زنگ در مسیر جریان استفاده می کند. در مسیر جریان FPLC، از فولاد ضد زنگ اجتناب می شود و با تیتانیوم، PEEK و سایر کامپوزیت های با کارایی بالا جایگزین می شود.

HPLC برای جداسازی ترکیبات با وزن مولکولی کوچک استفاده می شود. FPLC برای خالص سازی بیومولکول های بزرگ مانند پروتئین ها، نوکلئوتیدها و پپتیدها استفاده می شود.

نرم افزار بین این دو تکنیک نیز متفاوت است.

نرم افزار کروماتوگرافی HPLC ابزار دقیق را کنترل کرده و داده ها را تجزیه و تحلیل می کند.

نرم افزار FPLC ماژول ها را کنترل می کند و همچنین جمع آوری نمونه های خالص شده را در fraction collector یکپارچه می کند.

سیستم های FPLC علاوه بر نظارت بر جذب UV، pH و رسانایی را نیز کنترل می کنند.

عملکرد هر دو HPLC و FPLC از زمان معرفی آنها بهبود یافته است.

در سال 1969، اولین HPLC توسط شرکت Waters به صورت تجاری معرفی شد.

اولین سیستم FPLC توسط Pharmacia در سال 1982 توسعه یافت.

امروزه، شرکت های بیشتری راه حل های HPLC را ارائه می دهند و راه حل های FPLC.

این شکل خاص از کروماتوگرافی برای خالص سازی بیومولکول های بزرگ چندین کیلودالتون (kDa) مانند پروتئین ها، نوکلئوتیدها یا پپتیدها استفاده می شود .

هدف کاربر FPLC بدست آوردن هرچه بیشتر محصول خالص و بومی است.

از سوی دیگر، اهداف HPLC کلاسیک، شناسایی و واجد شرایط بودن آنالیت‌ها، معمولاً ترکیبات کوچکی است که اندازه آنها از چند اتم تا تقریباً 3000 Da است.

چالش بدست آوردن پروتئین خالص از عصاره سلولی

به طور معمول، بیومولکول‌ها از سلول‌های باکتریایی یا یوکاریوتی که مملو از پروتئین‌ها، DNA، RNA و غشای سلولی هستند، خالص می‌شوند.

از این رو، خالص سازی پروتئین مورد نظر از عصاره سلولی می تواند بسیار چالش برانگیز باشد.

بیوشیمی‌ها چند ترفند را به کار می‌گیرند: یکی استفاده از پروتئین‌های نوترکیب که بیش از حد توسط سلول‌ها بیان می‌شوند.

بیان بیش از حد پروتئین مورد نظر، تخلیص را در مقادیر بیشتر امکان پذیر می کند.

ترفند دوم اضافه کردن یک برچسب tag به پروتئین مورد نظر است که به طور خاص توسط رزین (مواد ستون) تشخیص داده می شود.

پروتئین های بدون برچسب tag به ستون متصل نمی شوند و بلافاصله شستشو می شوند، در حالی که پروتئین مورد نظر غنی شده و به راحتی قابل جداسازی است.

مولکول‌های زیستی از لیزات lysates سلولی خالص می‌شوند، که به معنای حجم نمونه بسیار بزرگ‌تر از HPLC تحلیلی است.

بنابراین از حلقه های نمونه بزرگتر یا حتی پمپ هایی با دبی بالاتر برای تزریق نمونه استفاده می شود.

علاوه بر این، مواد ستون FPLC و HPLC کاملاً متفاوت هستند.

برای HPLC، دانه های سیلیکا با اندازه ذرات بسیار کوچک و با مقاومت زیاد در برابر فشارهای بالا استفاده می شود، در حالی که FPLC برای اکثر روش ها به مواد آگارز یا پلیمر با اندازه ذرات بزرگتر نیاز دارد.

رزین های مورد استفاده برای FPLC به اندازه دانه های سیلیکا در فشار پایدار نیستند و به حباب های هوا بسیار حساس هستند.

علاوه بر این، نه تنها مواد ستون، بلکه سخت افزار ستون نیز متفاوت است. در HPLC کلاسیک از ستون های فولادی ضدزنگ مقاوم در برابر فشار استفاده می شود.

همانطور که قبلا ذکر شد، پایداری فشار برای FPLC مهم نیست و بنابراین می توان با ستون های شیشه ای شفاف و زیست سازگار کار کرد. این یک مزیت بزرگ است زیرا کاربر می‌تواند ستون را برای حباب‌های هوا بررسی کند یا وضعیت مواد را در طول عملیات تخلیص کنترل کند.

بیومولکول های متنوع، روش های مختلف تخلیص

تفاوت در مواد ستون نیز در روش ها منعکس می شود.

در HPLC تحلیلی، کروماتوگرافی فاز معکوس با فازهای ثابت آبگریز و فازهای متحرک قطبی روش انتخابی است، در حالی که در FPLC روش های متنوع تری استفاده می شود .

یکی از روش های FPLC کروماتوگرافی حذف اندازه size-exclusion chromatography (SEC) است که در آن مولکول ها بر اساس اندازه آنها جدا می شوند.

مولکول‌های کوچک‌تر می‌توانند در منافذ مهره‌ها پخش شوند، در حالی که مولکول‌های بزرگ‌تر تقریباً بدون حفظ شدن از ستون عبور می‌کنند.

مولکول‌های کوچک‌تر بعداً از ستون شسته می‌شوند و شیب این مولکول‌ها را بر اساس اندازه‌شان ایجاد می‌کنند.

روش دیگر جداسازی کروماتوگرافی تبادل یونی ion-exchange chromatography است.

بیومولکول ها با توجه به بار خاص خود که به pH بافر بستگی دارد، جدا و خالص می شوند.

هرچه بار پروتئین بیشتر باشد، بهتر به رزین باردار مخالف متصل می شود.

برای شستشوی پروتئین از ستون، غلظت یون های نمک در طول اجرا افزایش می یابد.

یون های نمک برای اتصال به رزین با پروتئین رقابت می کنند.

یکی دیگر از روش های مهم FPLC کروماتوگرافی میل ترکیبی affinity chromatography است که در آن مولکول مورد نظر می تواند به طور خاص به ستون متصل شود در حالی که مولکول های دیگر نمی توانند و بدون اتصال شسته می شوند.

در اینجا از ستون هایی با محیط های مخصوص که مولکول زیستی مورد نظر را تشخیص می دهند استفاده می شود.

شکل خاصی از کروماتوگرافی میل ترکیبی affinity chromatography ، میل ترکیبی یون فلزی بی حرکت (IMAC) است.

پروتئین مورد نظر باید از نظر ژنتیکی با افزودن یک برچسب tag به پروتئین، که معمولاً از شش هیستیدین تشکیل شده است، تغییر یابد.

رزین IMAC به طور خاص این «تگ Hisâ» را تشخیص می دهد. شستشو با افزایش غلظت ایمیدازول انجام می شود که با پروتئین های دارای برچسب His رقابت می کند.

علاوه بر این، پروتئین‌ها را می‌توان با استفاده از روش جداسازی برهمکنش آبگریز hydrophobicity با آبگریزی خاص خود جدا کرد.

رزین به گونه ای ساخته شده است که آبگریزترین پروتئین ها قوی ترین ها را به ستون متصل می کنند و با کاهش گرادیان نمک شسته می شوند.

الزامات FPLC

پروتئین ها از اسیدهای آمینه تشکیل شده اند که به صورت زنجیره ای در کنار هم قرار گرفته اند. این زنجیره به شکل یک ساختار سه بعدی تا می شود که کلید عملکرد و فعالیت هر پروتئین است.

بنابراین، حفظ این ساختار پروتئینی در طول فرآیند تخلیص بسیار مهم است.

عوامل خارجی مانند دمای بالا، فشار بالا، pH شدید یا حلال ها می توانند ساختار پروتئین را مختل کنند و بنابراین در FPLC از آنها اجتناب می شود.

دمای کار برای پروتئین ها معمولاً 4 درجه سانتیگراد است. به همین دلیل است که یک دستگاه FPLC اغلب در یک اتاق سرد یا اتاق سرد قرار می گیرد که در آن نه تنها در معرض دمای پایین بلکه در معرض رطوبت متراکم نیز قرار می گیرد.

اجزای یک سیستم FPLC باید به طور خاص برای این شرایط طراحی شوند. علاوه بر این، اجزای FPLC با یک چالش اضافی، یعنی محلول‌های بافر نمکی که به عنوان شوینده استفاده می‌شوند، مواجه می‌شوند.

معمولا pH ایزوسموز و غلظت نمک مشابه محیط سلول انتخاب می شود.

سیستم های کروماتوگرافی عموما از فولاد ضد زنگ ساخته می شوند.

از یک طرف نمک موجود در بافرها می تواند منجر به خوردگی شود و از طرف دیگر یون های فلزی از فولاد ضد زنگ می توانند با پروتئین تداخل کرده و ساختار آن را مختل کنند. بنابراین، اجتناب از فولاد ضد زنگ و استفاده از مواد زیست سازگار مانند سرامیک پلی اتر اتر کتون (PEEK) در هنگام اجرای FPLC مهم است.

مانند سیستم های HPLC، سیستم های FPLC نیز توسط نرم افزار کنترل می شوند.

تفاوت های قابل توجهی بین نرم افزار FPLC و HPLC وجود دارد.

مورد دوم عمدتاً برای تجزیه و تحلیل نمونه ها استفاده می شود و حاوی ابزارهای تحلیلی زیادی است.

با این حال، در FPLC، ابزارهای تحلیلی زیادی مورد نیاز نیست و معمولاً روش‌هایی بر اساس حجم یا حتی حجم ستون تولید می‌شود

برای اکثر برنامه های کاربردی FPLC، روش های مبتنی بر حجم ستون ترجیح داده می شوند، که افزایش مقیاس را آسان می کند.

نرم افزار FPLC عمدتاً بسیار بصری و کاربرپسند است و شامل کنترل مستقیم است که امکان تنظیم پارامترها را در طول اجرا فراهم می کند. بنابراین، کاربر می تواند به موقعیت های مختلف به طور بسیار خودجوش واکنش نشان دهد.

آیا می توانم از ستون HPLC در FPLC استفاده کنم؟

بله، تا زمانی که فشار برگشت ستون HPLC از حد فشار برگشتی سیستم FPLC تجاوز نکند

چرا FPLC بهتر از HPLC است؟

سر پمپ های FPLC از مواد تیتانیوم یا PEEK ساخته شده اند و پمپ های رومیزی می توانند نرخ جریانی تا 150 میلی لیتر در دقیقه را ارائه دهند اما فشار برگشتی تقریباً 725 psi در این نرخ های جریان بالا دارند.

نرخ جریان در FPLC معمولاً بالاتر از HPLC است، جایی که فشارهای برگشتی معمولاً کمتر است.

محدودیت های FPLC چیست؟

برای استفاده آسان، طیف گسترده ای از ستون های از پیش بسته بندی شده pre-packed برای تکنیک هایی مانند تبادل یونی ion exchange، فیلتراسیون ژل (حذف اندازه) gel filtration (size exclusion)، برهمکنش آبگریز hydrophobic interaction و کروماتوگرافی میل ترکیبی affinity chromatography در دسترس هستند.

تفاوت FPLC با HPLC در این است که ستون های مورد استفاده برای FPLC فقط تا حداکثر فشار 3-4 MPa (435-580 psi) قابل استفاده هستند.

کدام کروماتوگرافی برای خالص سازی پروتئین بهتر است؟

کروماتوگرافی میل ترکیبی affinity chromatography

در میان تمام تکنیک های کروماتوگرافی، کروماتوگرافی میل ترکیبی affinity chromatography

نقش اصلی را ایفا می کند. در واقع، کروماتوگرافی میل ترکیبی خاص ترین و موثرترین تکنیک خالص سازی پروتئین است که مبنای منطقی را برای خالص سازی پروتئین های هدف فراهم می کند.

چه نوع ستون هایی در FPLC استفاده می شود؟

انواع ستون FPLC

ستون‌های کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل (همچنین به عنوان یک اندازه حذف شناخته می‌شود).

لیست مقالات

مقالات