تعیین فلورومتری آلومینیوم در محصولات دارویی با استفاده از طیف سنج فلورسانس FL6500

مقدمه

بر اساس توانایی افزایش پاسخ سیستم ایمنی immune system، نمک های آلومینیوم مانند سولفات آلومینیوم پتاسیم، فسفات آلومینیوم و اکسی هیدروکسید آلومینیوم به طور گسترده در فرایند ساخت به عنوان کمکی در واکسن های مجاز از سال 1926 استفاده شده اند.

به عنوان مواد فعال، تعیین کمیت نمک های آلومینیوم در فرمولاسیون واکسن در طول فرآیند تولید مورد نیاز است.

تعیین آلومینیوم در آب مورد استفاده برای تهیه مایعات دیالیز نیز برای نظارت بر تجمع زیستی که ممکن است منجر به سمیت در بیماران تحت درمان همودیالیز شود، بسیار مهم است.

در این مقاله کاربردی، از طیف‌سنج فلورسانس PerkinElmer FL6500TM (FL8500 نیز می‌توان استفاده کرد) برای تعیین غلظت آلومینیوم در محلول با بهره‌برداری از افزایش 8-هیدروکسی کینولین هنگام کمپلکس شدن با یون فلزی استفاده شد.

در قسمت اول از روش Ph.Eur.2.4.17 استفاده و استخراج با 8-هیدروکسی کینولین در کلروفرم انجام شد.

در بخش دوم، یک روش جایگزین پیشنهاد شده است که برای آن یک منحنی کالیبراسیون که از حلال‌های کلردار اجتناب می‌کند و دقت بالاتری را ارائه می‌دهد با استفاده از حالت کمی‌سازی طول موج Wavelength Quantification Mode موجود در نرم‌افزار Spectrum® FL ایجاد شد.

مواد و روش ها

تمام معرف‌های زیر از سیگما آلدریچ خریداری شده و بدون هیچ گونه purification بیشتر به‌صورت دریافتی مورد استفاده قرار گرفته‌اند:

دودکاهیدرات سولفات آلومینیوم پتاسیم (آلوم، ≥ 98%)،

8-هیدروکسی کینولین (≥ 98.5%)

کلروفرم (گرید HPLC Plus، ≥ 99.9%)

اتانول (مطلق، ≥ 99.9%)

استات سدیم بدون آب (> 99%).

اسید استیک گلاسیال (≥ 99.7٪) از Honeywell Fluka خریداری شد.

برای تهیه محلول های آبی از آب Milli-Q استفاده شد.

متد Ph.Eur.2.4.17 Method (01/2008:20417)

8-hydroxyquinoline (HQ) 5 g/L با حل کردن 1.25 گرم از 8-hydroxyquinoline در 250 میلی لیتر کلروفرم تهیه شد.
محلول استوک آلومینیوم 100 ppm با حل 80 میلی گرم دودکاهیدرات سولفات آلومینیوم پتاسیم در 45 میلی لیتر آب میلی لیتر تهیه شد.
محلول آلومینیوم 2 ppm با رقیق کردن محلول استوک آلومینیوم (2 میلی لیتر (100 پی پی ام) + 98 میلی لیتر میلی لیتر آب) تهیه شد.
بافر استات 0.1 مولار pH 6 با حل کردن 1.95 گرم استات سدیم بی آب و افزودن 0.07 میلی لیتر استیک یخچالی به حجم نهایی 250 میلی لیتر تهیه شد.

طیف فلورسانس

طیف فلورسانس محلول‌های کاری پس از استخراج (کمپلکس‌های HQ-Al و بلانک) در طیف‌سنج فلورسانس FL6500 با استفاده از یک کووت کوارتز فلورسانس به طول مسیر 1 سانتی‌متری که در یک نگهدارنده تک سلولی قرار داده شده است، جمع‌آوری شد.

تمام طیف های فلورسانس با انتشار کلروفرم کم شد.

تنظیمات اسکن طیف مورد استفاده با نرم افزار Spectrum® FL در جدول 1 گزارش شده است.

جدول 1: تنظیمات اسکن طیف FL6500 که برای مجموعه طیف فلورسانس استفاده می شود.

تعیین فلورومتری آلومینیوم در محصولات دارویی

روش منحنی کالیبراسیون

منحنی کالیبراسیون با انتقال حجم 2500 میکرولیتری از محلول HQ 2.5 گرم در لیتر به یک کووت کوارتز فلورومتریک و افزودن مستقیم حجم های بعدی از آلومینیوم ppm 20 و محلول های آب 45 ppm به دست آمد تا محدوده غلظت های Al 0 تا 1 ppm را پوشش دهد.

حجم های اضافه شده برای نادیده گرفتن فاکتور رقت (از 1 تا 20 میکرولیتر تا حجم نهایی 2561 میکرولیتر) انتخاب شدند.

حالت کمی طول موج موجود در نرم افزار Spectrum® FL برای جمع آوری شدت فلورسانس در FL6500 با زمان ادغام 1000 میلی ثانیه در λem = 518 نانومتر استفاده شد که نمونه را در λexc = 392 نانومتر برانگیخت (جدول 2 را ببینید).

شدت فلورسانس پس از تکان دادن دستی کووت بین هر اکتساب در سه تکرار جمع‌آوری شد.

سه آزمایش مستقل با محلول‌های تازه برای تأیید روش منحنی کالیبراسیون تکرار شد.

ضرایب همبستگی (R2) به‌دست‌آمده همیشه بالاتر از 0.99 است که نشان‌دهنده تکرارپذیری و دقت روش پیشنهادی در محدوده غلظت آلومینیوم 0 تا 1 ppm است.

نتایج

روش Ph.Eur.2.4.17 (01/2008:20417)

طیف فلورسانس (λexc = 392 نانومتر) محلول Blank (بدون آلومینیوم)، محلول مرجع (1 ppm آلومینیوم) و سه محلول آزمایش شده (به ترتیب ppb 10، ppb 30 و ppb آلومینیوم 500) پس از استخراج با 8-هیدروکسی کینولین (HQ) جمع آوری شد. ) در کلروفرم (شکل 1 را ببینید).

همانطور که در روش Ph.Eur.2.4.17 بیان شد، در صورتی که اختلاف شدت فلورسانس ITest – IBlank کمتر از IRReference – IBlank باشد، محلول آزمایش تست اعتبار سنجی را پشت سر می گذارد (به معادله 1 مراجعه کنید).

FL6500 طیف سنج فلورسانس و تنظیمات اسکن طیف مورد استفاده با نرم افزار Spectrum FL امکان تشخیص افزایش شدت فلورسانس (λem = 518 نانومتر) را حتی زمانی که 10 ppb آلومینیوم در محلول آبی وجود داشت را می دهد.

نتایج گزارش شده در جدول 3 نشان داد که هر محلول آزمایش شده می تواند از آزمون اعتبار سنجی فارمکوپه عبور کند.

شکل 1: طیف انتشار (λexc = 392 نانومتر) محلول مرجع (Al 1 ppm، خط صورتی)، محلول blank (Al 0 ppm، خط سیاه) و محلول آزمایش 1 (Al 10 ppb، خط قرمز)، محلول آزمایش 2 ( Al 30 ppb، خط آبی) و محلول 3 (Al 500 ppb، خط سبز) پس از استخراج با HQ در کلروفرم.

حالت کمی سازی طول موج FL6500 برای منحنی کالیبراسیون استفاده می شود.

روش منحنی کالیبراسیون

در این مقاله کاربردی، یک روش منحنی کالیبراسیون برای دستیابی به تعیین دقیق آلومینیوم در محلول آبی بدون استفاده از حلال‌های کلردار درگیر در فرآیند استخراج توسعه داده شد.

اتانول به دلیل اختلاط پذیری با آب به عنوان حلال برای حل کردن 8-هیدروکسی کینولین انتخاب شد.

به این ترتیب، محلول های آبی استاندارد آلومینیوم را می توان مستقیماً به کووت اضافه کرد تا امکان تشخیص سریع افزایش فلورسانس کمپلکس HQ-Al و ساخت یک منحنی کالیبراسیون (شکل 2 را ببینید).

در حالی که روش Ph.Eur.2.4.17 فقط اجازه می دهد تا تعیین کنید که آیا محلول آزمایش شده حاوی آلومینیوم کمتری نسبت به محلول مرجع نسبت به محلول خالی است، منحنی کالیبراسیون جمع آوری شده در FL6500 با استفاده از حالت کمی طول موج، کمی سازی سریع و دقیق آلومینیوم را ارائه می کند.

افزودن حجم های مختلف محلول آلومینیوم در سه آزمایش مختلف برای ارزیابی دقت منحنی کالیبراسیون مجاز است.

مقادیر به دست آمده در جدول 4 گزارش شده است که درجه بالایی از دقت پیش بینی را نشان می دهد.

نتیجه گیری

افزایش فلورسانس مشاهده شده هنگامی که آلومینیوم در آب با 8-هیدروکسی کینولین در کلروفرم استخراج می شود با استفاده از طیف سنج فلورسانس PerkinElmer FL6500 شناسایی شد.

تنظیمات اسکن طیفی اجازه می دهد تا تعیین کند که آیا یک نمونه از آزمون اعتبار سنجی مطابق Ph.Eur.2.4.17 حتی برای محلول هایی با تنها ppb 10 آلومینیوم عبور می کند یا خیر.

علاوه بر این، یک روش جایگزین که یک منحنی کالیبراسیون ایجاد می کند و از استفاده از حلال های کلردار اجتناب می کند در این یادداشت کاربردی پیشنهاد شده است.

حالت کمی طول موج ارائه شده توسط نرم افزار Spectrum® FL اجازه می دهد تا به سرعت یک منحنی کالیبراسیون با دقت بالا ایجاد کند.

روش پیشنهادی ساده و در عین حال بسیار دقیق است که یک راه حل معتبر برای کمی سازی آلومینیوم در طول ساخت فرمولاسیون واکسن یا مایعات دیالیز را نشان می دهد.